近日，山东大学生命科学学院刘利静团队和北京大学现代农业研究院张华伟团队合作在the plant journal 发表了题为“a rapid and highly efficient sorghum transformation strategy using grf4-gif1/ternary vector system”的研究论文，该研究通过将发育调节因子与辅助质粒相结合构建三元载体系统，显著提高了高粱的转化效率并且缩短了转化周期。在此基础上他们建立了高效的高粱crispr/cas9基因编辑工具，并在t0代获得了两个靶基因的敲除突变体。
高粱（sorghum bicolor (l.) moench）是全球第五大主要谷类作物，具有广泛的用途，可用于食品、饲料和燃料等。与许多其他作物一样，高粱的遗传转化面临着许多挑战。近年来，利用发育辅助因子如baby boom (bbm)和wuschel2 (wus2)提高高粱转化效率的研究取得了显著进展。然而，bbm和wus2的持续过表达会对植物发育产生不利影响，包括扭曲叶片和降低育性。为了减轻这些负面影响，通常在芽再生前切除bbm和wus2的表达框或使用利他形态基因辅助转化(altruistic morphogene-assisted transformation, mat)。但这些方法由于发育辅助因子的切除或插入不足，增加了高粱转化的工作量，降低了有效转化效率。
作者将发育辅助因子grf4-gif1与辅助质粒pvs1-vir2相结合，对高粱品种wheatland进行转化。转化后13天可以在愈伤上观察到dsred红色荧光。采用针对nptii基因的卡那霉素对转化愈伤组织进行筛选。转化成功的愈伤组织在有卡那霉素的愈伤诱导培养基上正常生长，且在带有卡那霉素的发芽培养基上，能够诱导出芽，随后在生根培养基中生根为正常植株。将转化植株转移到土壤中后用pcr技术对转化植物进行验证。研究发现，grf4-gif1与bbm-wus类似，显著提高了高粱的转化效率，且相较于bbm-wus介导的高粱转化，grf4-gif1缩短了高粱的转化周期。更重要的是，表达grf4-gif1的转基因高粱植物在t0代中没有表现出明显的生长缺陷。同时，研究证明辅助质粒的引入进一步将grf4-gif1的转化效率提高至38.28%，是原始系统的7.71倍。
高效转化是crispr/cas9介导的基因编辑在基因功能研究和作物育种中成功应用的关键。作者也将crispr/cas9引入grf4-gif1/三元载体体系，构建了高效的高粱基因组编辑工具，并将其命名为grf4-gif1-cas。为了评估grf4-gif1-cas的编辑效率，作者设计了两个靶向pds基因的sgrna和两个靶向bmr-6基因的sgrna，基因的平均编辑效率为41.36%。且pds和bmr-6在t0代都获得了敲除突变体，相应的，这些植物表现出白化或棕色中脉表型。这些结果表明，grf4-gif1-cas是高效的高粱基因编辑工具。
综上所述，本研究通过grf4-gif1与辅助质粒的结合，成功建立了一个快速高效的高粱转化体系和基因编辑体系，为以后高粱的基因功能研究和分子育种奠定了坚实的基础。
山东大学生命科学学院博士生李俊朋为该论文第一作者，山东大学生命科学学院刘利静教授与北京大学现代农业研究院张华伟研究员为通讯作者，北京大学现代农业研究院博士后潘文波、山东大学生命科学学院硕士生张帅、马囯婧和副研究员李爱霞均作出重要贡献。该研究得到了国家重点研发计划(2022yfd1201700)和国家自然科学基金(32101685)的支持。
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