近期，山东大学微生物技术国家重点实验室生物质资源转化团队在木质纤维素生物质降解酶的改造及高效生产等研究方面取得了一系列新进展。
（1）在β-葡萄糖苷酶与木质素的结合机制及其理性改造方面：β-葡萄糖苷酶作为生物质降解酶系的一种重要限速组分，其与木质纤维素原料中木质素、可溶性酚类物质的结合影响整体酶系的降解效率。丹麦科学家曾于2013年报道两种主流商品酶制剂来源的β-葡萄糖苷酶与木质素的结合能力存在巨大差异，但相关机制尚不明确。研究团队发现，草酸青霉bgl1和烟曲霉bgl3这两种不同来源β-葡萄糖苷酶的性质存在明显差异：bgl1与微晶纤维素的结合能力较强而与木质素的结合能力较弱，可溶性酚类物质对该酶的活性表现出较强的抑制作用；bgl3在纤维素上的吸附能力较弱，而木质素则对其表现出强的吸附能力，且该酶对游离的酚类物质不敏感。通过分子对接对β-葡萄糖苷酶与木质素的结合位点进行分析，推测fniii结构域是导致两种酶性质差异的关键因素。进一步通过构建两个嵌合蛋白bgl1-3（bgl1催化域与bgl3的fnⅲ域融合）和bgl3-1（bgl3催化域与bgl1的fnⅲ域融合），证实了上述假设。获得的嵌合β-葡萄糖苷酶，可溶性酚类物质对其活性的抑制作用明显降低，对预处理玉米秸秆的酶解效率增加。该研究为β-葡萄糖苷酶的理性改造提供了新的视角。
图1 嵌合β-葡萄糖苷酶的吸附特征
该研究以“improving enzymatic efficiency of β-glucosidases in cellulase system by altering its binding behavior to the insoluble substrate during bioconversion of lignocellulose”为题发表于生物工程领域期刊bioresource technology（中科院一区，if 11.4）。卢宪芹副研究员为论文的第一作者，赵建教授为论文的通讯作者，山东大学微生物技术国家重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。
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（2）在以木质纤维素水解液为原料的纤维素酶现场生产策略研究方面：纤维素酶系的高效、低成本生产是降低木质纤维糖生产成本，促进木质纤维素生物转化进入商业化生产的关键环节。经典的纤维素酶发酵生产工艺依赖乳糖、槐糖、纤维素等诱导物的添加，原料成本高且发酵过程的调控难度大。直接以预处理秸秆等原料为碳源和诱导物的“整合现场产酶”（integrated on-site enzyme production）策略有利于节省成本，但存在固体原料补料难度大、产酶水平低等缺点，难以大规模实施。针对上述难题，研究团队提出了以木质纤维素水解液为原料的新型整合现场产酶策略。首先，通过重塑纤维素酶转录调控模式，构建了能够以葡萄糖为唯一碳源发酵生产纤维素酶的菌株，并通过蛋白质组手段证实其在葡萄糖培养基中能够有效表达主要纤维素酶和半纤维素酶组分；进一步通过表达异源b-葡萄糖苷酶，显著提升了整个酶系的糖化效率。利用工程菌株生产的粗酶液和间歇补料水解工艺，水解预处理玉米秸秆，获得了葡萄糖浓度为166.67 g/l的秸秆糖液。利用该秸秆糖液替代淀粉来源的葡萄糖作为培养基，在5 l发酵罐上采用补料发酵工艺生产纤维素酶，发酵液的滤纸酶活力可达到60.4 u/ml，且该酶液的糖化效率高于使用淀粉糖进行补料发酵生产出的酶液的糖化效率。基于上述结果，提出了使用木质纤维素转化系统内部的水解液进行“闭环”现场产酶的策略。当以汽爆-亚硫酸铵预处理并经水洗的玉米秸秆为原料时，用于产酶的水解液仅占全部水解液的3.1%。该研究为纤维素酶现场生产中兼顾原料成本与发酵水平提供了一种新的凯发k8国际娱乐官网入口的解决方案。
图2 以木质纤维素水解液为原料的纤维素酶现场生产策略
该研究以“a closed-loop strategy for on-site production of saccharolytic enzymes for lignocellulose biorefinery using internal lignocellulosic hydrolysates”为题发表于化工领域期刊chemical engineering journal（中科院一区，if 15.1）。博士研究生赵芹芹和张政为论文的共同第一作者，刘国栋副教授和赵建教授为论文的通讯作者，山东大学微生物技术国家重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。相关研究成果已获得专利授权（专利号zl 202111041885.6），目前正在企业进行放大测试。
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（3）在木质纤维素降解酶转录激活因子xyr1的半理性改造方面：锌簇家族的转录因子xyr1是调控里氏木霉纤维素酶和半纤维素酶表达的关键激活蛋白。前期，来自荷兰、奥地利等国的研究者基于对诱变菌株的研究发现，xyr1及其直系同源蛋白的v821f或a824v点突变可使其呈现持续激活的特性，从而使得菌株在不含诱导物的培养基上表达木质纤维素降解酶，即所谓“glucose blind”表型。此外，使用高强度启动子控制xyr1编码基因的表达或者替换其转录激活结构域，也可实现xyr1的持续激活。然而，由于缺乏蛋白结构信息，对xyr1活性的（半）理性改造尚难以开展。研究团队基于alphafold2预测的蛋白三维结构，推测第873位丙氨酸可能为xyr1改造的新型潜在靶点。使用crispr基因编辑技术对该位点进行了基因组原位随机突变，发现该残基突变为酪氨酸时，菌株在以纤维素为碳源的培养基中木聚糖酶和纤维素酶的产量均显著提高。此外，当以葡萄糖作为唯一碳源时，菌株能够不依赖诱导物合成分泌木聚糖酶和纤维素酶，且其产量高于前人报道的v821f突变株。a873y菌株分泌的胞外酶系中木聚糖降解酶系所占比例显著提升，对玉米皮、碱预处理玉米秸秆的糖化能力也显著提高。该研究为利用里氏木霉通过葡萄糖补料发酵等方式生产木质纤维素降解酶提供了一种新的菌株改造策略，也将有助于进一步理解xyr1活性调节的分子机制。
图3 xyr1新改造靶点的发现与应用
该研究以“structure-guided engineering of transcriptional activator xyr1 for inducer-free production of lignocellulolytic enzymes in trichoderma reesei”为题发表于生物工程领域期刊synthetic and systems biotechnology（中科院一区）。博士研究生赵芹芹为论文的第一作者，刘国栋副教授为论文的通讯作者，山东大学微生物技术国家重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。泰山学堂本科生杨泽正也参与了研究工作。
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近年来，生物质资源转化团队面向国家重大需求，在木质纤维素降解酶系的定制化设计、酶系的高效生产、生物质原料定向制备纳米纤维素等方面取得了较好进展。研究成果先后发表在carbohydrate polymers（2020, 2022, 2023a, 2023b, 2023c）、green chemistry（2022）、chemical engineering journal（2023）、bioresource technology（2023a, 2023b）等期刊，部分研究成果正在与企业开展合作以便进行产业化实施。
上述研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省自然科学基金、山东省重点研发计划等项目的支持。
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